卵母细胞成熟

（一）卵母细胞减数分裂

卵母细胞成熟是指卵母细胞减数分裂的过程，故又称为成熟分裂或减数分裂。卵母细胞的减数分裂包括两次分裂过程。第一次减数分裂开始于胎儿3个月时，该过程被人为地划分为四期：前期、中期、后期和末期。卵母细胞在第一次减数分裂前期停滞的时间很长，可持续数周、数月，甚至几十年，直到青春期或绝经期前四五十年才完成。在这漫长的过程中，很多卵母细胞特有的事件发生，包括同源染色体相互识别、配对、联会和重组，RNA和蛋白质合成。第一次减数分裂在卵巢内完成，经过排卵过程等待受精。根据染色质（体）的形态特征，可分为五个亚期，即细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。

细线期：初级卵母细胞的核内染色质最初是颗粒状的，后因发生凝集，形成细长纤维丝，逐渐折叠，螺旋化，变粗变短，丝上有大小不等的染色粒，联会复合体形成。此期初级卵母细胞主要表现为细胞核体积增大，伴随细胞内不成对的染色体出现，核圆形呈空泡状，核仁嗜碱性减弱。孕3～4个月胎儿性腺皮质，可以发现大量卵原细胞和卵泡细胞有丝分裂相，但皮质深部出现了进入减数分裂前期的卵母细胞。此时卵母细胞仅处于细线期，少数进入到偶线期。

偶线期：母源和父源的染色质细丝，相互靠近、识别、配对，形成二价体。此期核膜不清晰不完整，此期很短。孕7个月的胎儿卵巢皮质中不再出现处于细线期和偶线期的卵细胞。

粗线期：双价体的细丝缩短变粗。此期完成了同源染色体的联合，配对的同源染色体更粗更短更显而易见，可见明显的核仁。处于粗线期的卵母细胞最早出现在孕19周胎儿卵巢内，孕27周时最明显，孕36周后逐渐减少。

双线期：第四步同源染色体开始分离，此时每条染色体自己又分裂为两条子染色体，这样双价同源的单位合中有分，实为四分体。异源子染色体间可发生互换的交叉，出现特征性的十字形。母亲受孕28周胎儿卵巢内时首次看到双线期的卵母细胞，随妊娠进展逐渐增加。早期双线期表现为由以前粗短宽的染色体逐渐变得细长、浅染，此时同系染色体发生了纵向分散，形如网，故双线期后期又称核网期，此期是胎儿卵母细胞发育的最高阶段。胎龄9个月的卵巢内初级卵母细胞几乎全部进入双线期。卵母细胞停滞于双线期的阶段很长，直至恢复减数分裂或发生闭锁，可持续数天、数年，甚至数十年。此期除了染色体似网状外很少出现其他变化，故认为此期是“静止期”，细胞的超微结构可见高尔基复合体、内质网、线粒体和双层板，在近核的胞质处有新月状胞质区又称囊核复合体。“静止期”也意味着细胞中代谢活动减弱，RNA转录活跃，为卵母细胞成熟、受精及胚胎发育做物质储备。

终变期：染色体变粗变短，各对双价体彼此进一步分离。RNA转录活动逐渐停止。

第一次减数分裂的中期、后期和末期与有丝分裂过程相似。第一次减数分裂末期，卵母细胞分裂一次，染色体数目减半，由初级卵母细胞分裂为1个次级卵母细胞和1个极体，即第一极体。

第二次分裂时间很短促，是在排卵之后受精进行中完成，包括染色体的复制、同源染色体配对与重组、交换。精子进入卵母细胞后，卵母细胞分裂1次，排出第二极体，完成第二次减数分裂。减数分裂过程中染色体只复制一次，而细胞分裂两次，所以染色体数减半，成熟卵子是单倍体，只有受精的受精卵恢复为双倍体。

形态学上，根据光镜观察特征，卵母细胞被大致分为四个发育阶段：

生发泡期（GV）：光镜观察此期卵母细胞有一完整的球形核，内有单个核仁，清晰可见，胞质中心略黑，呈颗粒状，卵周隙较大，无第一极体，形态学上称为生发泡。

生发泡破裂期（GVBD）：生发泡结构破裂、消失，称之为生发泡破裂，此期时间很短，持续数小时。

第一次减数分裂中期（MⅠ）：光镜下未见生发泡，也无第一极体，胞质圆满均匀，将具有此种光镜特征的卵母细胞统称为MⅠ期，事实上囊括了第一次减数分裂前期至终变期（GVBD）和第一次减数分裂中后期。

第二次减数分裂中期（MⅡ）：卵母细胞完成第一次减数分裂后，变成次级卵母细胞并伴有第一极体，迅速度过第二次减数分裂前期进入第二次减数分裂中期，并停止在此期，等待受精。形态学上，将具有第一极体的卵母细胞统称为M Ⅱ期。若无精子结合，则卵母细胞不能完成第二次减数分裂，停滞于MⅡ期逐渐老化，凋亡。一旦有精子进入，激活MⅡ卵母细胞突破MⅡ停滞，排出第二极体。受精卵恢复二倍体，进入后续有丝分裂的胚胎发育阶段。

（二）卵母细胞减数分裂的调控

关于人卵母细胞减数分裂过程的调控机制，由于受到伦理、标本来源及技术手段的限制，研究相对较少。因此，人们对于卵母细胞减数分裂过程的认识，主要借鉴了动物研究结果，尤其是啮齿类和灵长类动物研究。

卵母细胞减数分裂过程受卵巢局部因子和下丘脑-垂体-卵巢轴的共同调控，共存在三个关键调控点：第一次减数分裂前期、第一次减数分裂中/后期、第二次减数分裂中期。既有卵巢局部调控，也有机体系统调节。卵巢局部存在胰岛素样生长因子1、表皮生长因子/转化生长因子α、白细胞介素1、肿瘤坏死因子α等多种因子调节卵细胞的发育与成熟。机体通过下丘脑同时接受下丘脑-垂体-卵巢所释放的各种激素的综合协调控制。性成熟后，在促性腺激素及其他内分泌、自分泌、旁分泌因子作用下，卵母细胞内环磷酸腺苷水平下降，激活成熟促进因子，启动第一次减数分裂进入终变期；此后，细胞静止因子、后期促进复合物、蛋白激酶C等蛋白因子在G蛋白耦联受体信号途径、磷脂酰肌醇信号通路、酪氨酸激酶信号通路、泛素-蛋白酶体等信号通路的调控作用下，促进第一次减数分裂和第二次减数分裂完成。促性腺激素FSH和LH对卵母细胞减数分裂过程的调控是通过卵丘颗粒细胞-卵母细胞对话通路实现的。

调控卵母细胞减数分裂的关键因子及信号通路包括：

1.减数分裂关键蛋白

（1）成熟促进因子（maturation-promoting factor，MPF）：

减数分裂过程中DNA复制一次，细胞分裂两次，是生殖细胞特有的过程。卵母细胞成熟过程中GV期→MⅠ期和MⅠ期→MⅡ期的转换需要MPF参与。MPF的合成与降解、活性的增加与减少调控卵母细胞细胞周期的进程。

研究发现未成熟卵母细胞中MPF活性很低，在促性腺激素FSH、LH作用下发生GVBD，MPF活性增加并达到高峰；随后卵母细胞进入中期Ⅰ（metaphase I，MⅠ）和后期Ⅰ（anaphase Ⅰ），MPF活性降低；接着卵母细胞排除第一极体，进入MⅡ（metaphase Ⅱ，MⅡ）期，MPF活性又随之增加，并且维持数个小时，在MⅡ阻滞过程中保持高水平。卵母细胞受精时，MPF活性降低，使卵子克服MⅡ期阻滞，促进姐妹染色单体的分离和第二极体的排出，完成第二次减数分裂。受精后，MPF活性在合子第一次有丝分裂和第二次有丝分裂时达到峰值。

（2）细胞静止因子（cytostatic factor，CSF）：

CSF主要发挥维持MPF活性、保持MⅡ阻滞的作用。受精后在Ca ²⁺ 的作用下，CSF活性下降，下调MPF活性，卵母细胞解除MⅡ期阻滞，完成减数分裂。

（3）后期促进复合物（anaphase promoting complex，APC）：

后期促进复合物是一种E ₃ 泛素连接酶，其活性是MPF所需，促使GVBD发生、MⅠ/ MⅡ转变以及第二次减数分裂过程中参与纺锤体装配、极体排出和cyclin B降解。

（4）纺锤体检验点蛋白：

细胞分裂过程中存在着一种纺锤体装配检验点（spindle assembly checkpoint，SAC），可以延迟细胞进入分裂后期，直到所有的染色体都通过着丝粒连接到纺锤体上。SAC通过着丝粒蛋白抑制后期促进复合物/循环体（APC/C）活性，阻碍cyclin B降解，维持卵母细胞中高水平的MPF，阻止细胞分裂进入后期。主要参与第一次减数分裂同源染色体分离过程和第二次减数分裂姐妹染色单体分离。

2.FSH/LH调控卵母细胞减数分裂的信号通路

促性腺激素FSH和LH对卵母细胞减数分裂过程的调控是通过卵丘颗粒细胞-卵母细胞对话通路实现的。FSH受体和LH受体都是G蛋白耦联受体。LHR是由FSH与E2协同诱导形成的。FSH/LH与卵丘颗粒细胞上的受体结合，通过G蛋白耦联受体信号途径、磷脂酰肌醇信号通路、酪氨酸激酶信号通路、泛素-蛋白酶体通路等信号通路，借助颗粒细胞-卵母细胞之间的缝隙连接进入卵母细胞内，调控基因表达和蛋白活性。FSH受体、LH受体表达除了受自身配体和内分泌激素的反馈调节之外，生长因子对其同样具有调控作用：类胰岛素样生长因子I（IGF-I）可增加LHR的表达。转录生长因子β（TGF-β）和FSH可协同促进颗粒细胞表达LHR。另外，表皮生长因子（EGF）主要是通过抑制受体合成使LH/HCG受体水平下降。

（1）激素→G蛋白耦联受体→G蛋白→腺苷酸环化酶→cAMP→PKA→基因调控蛋白→基因转录。卵母细胞中的cAMP水平影响MPF的活性。高水平的cAMP使MPF失活，卵母细胞停滞在第一次减数分裂前期；cAMP水平的下降则产生相反的作用。

磷酸二酯酶3A（phosphodiesterase 3A，PDE3A）是小鼠卵母细胞中一种主要的磷酸二酯酶亚型。卵丘包围的卵母细胞中，PDE3A在LH受体作用下活化，通过水解cAMP促进第一次减数分裂恢复。此外，卵丘细胞中还存在PDE4亚型。抑制PDE3A活性会阻碍减数分裂恢复，而抑制PDE4活性却可以增强FSH活化卵丘细胞中MAPK的能力，诱导生发泡破裂（GVBD）发生。

（2）磷脂酰肌醇信号通路：磷脂酰肌醇信号通路涉及的反应链为：激素→G蛋白耦联受体→G蛋白→磷脂酶C→磷脂酰肌醇→二酰基甘油、肌醇三磷酸→Ca ²⁺ 、二酰基甘油→PKC→基因调控蛋白→基因转录。

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）在卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocytecomplex，COC）中发挥作用的部位决定其是促进还是抑制减数分裂恢复：卵丘细胞中PKC的激活促进卵母细胞恢复减数分裂，而卵母细胞中PKC的激活抑制其自身的成熟。这可能是由于两种细胞中表达不同PKC亚型，通过激活各自下游分子，产生不同效应。促减数分裂甾醇（meiosis activating sterols，MAS）是在促性腺激素刺激下由卵丘细胞产生的能促进哺乳动物生殖细胞减数分裂恢复的物质。在FSH作用下，卵丘细胞产生的MAS经由PKC信号途径诱导卵母细胞恢复减数分裂。

哺乳动物卵子中Ca ²⁺ 浓度的升高可以激活PKC，使卵子克服MⅡ期阻滞。

（3）酪氨酸激酶信号通路：RTK-Ras蛋白信号通路涉及的反应链为：配体→RTK→接头蛋白→鸟苷酸释放因子→MAPK通路、磷脂酰肌醇信号通路→进入细胞核→其他激酶或基因调控蛋白的磷酸化修饰。IGF、EGF、TGF生长因子的受体多为RTK型受体，通过此信号通路激活下游基因，协同促性腺激素调控卵成熟。

（4）泛素-蛋白酶体通路：后期促进复合物（APC）是一种E3泛素连接酶，其活性是成熟促进因子MPF所需。细胞静止因子CSF包含内源性减数分裂抑制因子2（endogenous meiotic inhibitor 2，Emi2）和癌蛋白Mos。CSF通过APC调控MPF活性，维持卵母细胞中高水平的MPF。另外，纺锤体装配检验点（SAC）通过着丝粒蛋白抑制APC活性，阻碍MPF活性降解，阻止细胞分裂进入后期，主要参与第一次减数分裂中同源染色体分离过程和第二次减数分裂过程中姐妹染色单体分离。卵母细胞GVBD之前，颗粒细胞在FSH和LH作用下分泌孕酮、雌二醇（E ₂ ）等激素。孕酮刺激卵母细胞中癌蛋白c-Mos的合成，激活CSF，触发MPF激活和MAPK级联反应。MAPK的下游因子p90rsk磷酸化p34cdc2激酶的抑制性蛋白激酶MYT1，降低MYT1活性，促进MPF活化，刺激GVBD的发生。MAPK也可能通过磷酸化cyclin B1使其向卵母细胞核内转移，促进MPF活化和G2/M转化。在LH作用下，MAPK信号通路通过磷酸化连接蛋白43使卵泡细胞以及卵泡与卵母细胞间的缝隙连接中断，导致卵母细胞中cAMP水平下降。

人类卵子发生和成熟从胎儿期开始，持续近五十年。卵母细胞减数分裂是一个复杂的多因素、多通路调节过程。其调控过程包括卵巢局部因素和机体系统调节。卵巢局部生长因子与FSH/LH在卵泡发育过程中相互配合，作用于颗粒细胞，将FSH/LH峰对卵母细胞及整个卵泡的效应传递下去，调节卵泡成熟。其中任何关键细胞周期事件出现异常，卵母细胞都不能发育为正常的卵子。近年来，围绕G蛋白耦联受体介导的信号通路，对卵母细胞成熟调控的机制进行了较为系统的研究，但对人卵的研究还不够深入彻底，人卵母细胞成熟过程的许多调控机制尚存在争议和未知。随着单细胞水平等研究技术的突破，有望比较全面地阐明人卵母细胞发育成熟的调控机制，从而为女性内分泌疾病和不孕症的治疗提供理论依据。